試劑準(zhǔn)備：

　　1. DCFH-DA可稀釋于培養(yǎng)基或緩沖液中。血清或培養(yǎng)基顏色并不影響DCFH-DA及細(xì)胞內(nèi)熒光產(chǎn)生，但可能會(huì)影響熒光顯微鏡觀察，干擾熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀熒光測(cè)定。可將DCFH-DA稀釋于無(wú)酚紅培養(yǎng)基或適宜的緩沖液如PBS中。這依賴于使用何種熒光設(shè)備進(jìn)行測(cè)定。

　　2. 加入DCFH-DA的時(shí)機(jī)或孵育時(shí)間，以終能順利檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧為目的。藥物處理時(shí)間較短(<2小時(shí))或預(yù)計(jì)ROS效應(yīng)較弱，可先加或同時(shí)加入DCFH-DA。反之，treat 刺激時(shí)間較長(zhǎng)(>6 小時(shí))或預(yù)計(jì)產(chǎn)生ROS效應(yīng)較強(qiáng)，可后加DCFH-DA。

　　3. 活性氧供體含高純度12 mM H2O2。加入細(xì)胞后其本身即是一種活性氧，而且在代謝過(guò)程中可產(chǎn)生其它類型的活性氧，均可使DCFH-DA氧化為DCF呈現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光。因而，用戶可使用該試劑作為測(cè)試實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)或儀器的陽(yáng)性試劑，以初步觀察細(xì)胞活性氧所產(chǎn)生的熒光的一般特征，并且也可以將該實(shí)際作為實(shí)驗(yàn)的一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。推薦該試劑的細(xì)胞工作濃度為20~100 uM或更低濃度，但超過(guò)200uM將產(chǎn)生細(xì)胞毒。如果用戶熟悉ROS熒光或?qū)嶒?yàn)沒(méi)有必要采用陽(yáng)性對(duì)照，可以不加該試劑。