注意：本產(chǎn)品試劑組分和操作步驟發(fā)生變化，使用前請(qǐng)仔細(xì)閱讀說明書。 

保存：本產(chǎn)品對(duì)光敏感，應(yīng)該室溫避光儲(chǔ)存，保質(zhì)期 2 年。無菌開封后，保存于室溫。 

試劑盒組成： 

試劑 A 200mL 室溫避光 

試劑 C 100mL 室溫避光 

紅細(xì)胞沉降液 100mL 室溫 

細(xì)胞洗滌液 200mL 室溫 

操作步驟一： 紅細(xì)胞沉降（僅供參考） 

沉降去除紅細(xì)胞：

取脾臟單細(xì)胞懸液與血液稀釋液(注射用生理鹽水或 1XPBS)及紅細(xì)胞沉降液按照 1:1:1 比例混勻，室溫下靜置 30-40min 后，可見紅細(xì)胞沉于試管底部，小心吸取上清層(富含白細(xì)胞 及血小板)用于后續(xù)細(xì)胞分離。 

操作步驟二： 樣本分離（僅供參考） 

1. 樣本分離：當(dāng)樣本體積小于 5mL 時(shí),先在離心管中先加入 4mL 試 劑 A，后將 2mL 試劑 C 小心疊加于試劑 A 之上，形成梯度界面(樣 本體積大于等于 5mL，試劑 A 與試劑 C 比例 2:1，試劑總量等于沉 降后樣本含量),將懸液小心平鋪于分離液液面上方。由于密度差異， 可見明顯的分層界面(注意二者的總體積不能超過離心管的三分之二， 否則會(huì)影響分離效果)。 

2. 室溫條件下水平轉(zhuǎn)子 600-1000g ，25-30min(血液體積越大所需 離心力越大,離心時(shí)間越長(zhǎng),最佳分離條件需摸索，離心最大轉(zhuǎn)速不超 過 1000g)。

3. 離心后，離心管中可見兩個(gè)環(huán)狀乳白色層，上層為單個(gè)核細(xì)胞層,下層即所需中性粒細(xì)胞層(受 個(gè)體差異及分離條件影響，粒細(xì)胞白膜層可能會(huì)出現(xiàn)顏色較淺的情況)。 

4. 用吸管吸取下層中性粒細(xì)胞白膜層至新的離心管中，加入 10mL 細(xì)胞清洗液洗滌細(xì)胞，250g，離 心 10min。 

5. 棄上清,加入 5mL 細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞,250g，離心 5min。 

6. 棄上清，重懸細(xì)胞備用。

脾臟單細(xì)胞懸液制備： 

脾臟研磨的方法： 

1. 無菌條件下摘取脾臟，撕去脾臟被膜，用眼科剪將脾臟剪成小塊。 

2. 將尼龍篩網(wǎng)或者是細(xì)胞過濾篩放置于平皿上，加入少量全血及組織稀釋液（保證脾臟及獲得的 細(xì)胞處于液體環(huán)境中）。 

3. 將脾臟放置于篩網(wǎng)上，使用注射器活塞或者是無菌鑷子來研磨脾臟（盡量控制研磨力度，保持 篩網(wǎng)懸空，避免在皿底上直接研磨而造成大批細(xì)胞死亡） 

4. 研磨完全后使用全血及組織稀釋液沖洗篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液，再經(jīng)濾網(wǎng)過濾。 

注： 

A. 可用酶消化法，使用膠原酶對(duì)脾臟組織進(jìn)行消化，得到單細(xì)胞懸液。 

B. 如果最終得到的細(xì)胞需要培養(yǎng)，那全過程所需試劑與器材均要求無菌。 

C. 根據(jù)脾臟的體積控制單細(xì)胞懸液的濃度在 10 8 ~10 9個(gè)/mL。 

注意事項(xiàng)： 

A.開封前顛倒混勻，本分離液為無菌產(chǎn)品，為延長(zhǎng)分離液保存時(shí)間，請(qǐng)?jiān)跓o菌條件下啟封，避免 微生物污染。 

B.分離液使用時(shí)應(yīng)始終保持室溫（18℃~25℃），如室內(nèi)溫度較低，可將分離液預(yù)熱。4℃或者是 溫度較低的條件下離心，可能會(huì)導(dǎo)致白膜層不清晰。 

C.血液樣本最好為新鮮抗凝血（采血 2h 以內(nèi)），為保持中性粒細(xì)胞的活性，應(yīng)避免冷凍和冷藏。 

D.稀釋血液或洗滌細(xì)胞，不可使用含 Ca、Mg 離子的緩沖液及培養(yǎng)液，其成分會(huì)導(dǎo)致血細(xì)胞凝集， 大大降低細(xì)胞得率及純度。 

E.部分塑料制品（如聚苯乙烯）因其帶有的靜電作用，可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞掛壁，影響分離效果。 

F.血液樣本的粘稠度或者是溫度差異，可能會(huì)影響分離效果，可以調(diào)節(jié)離心轉(zhuǎn)數(shù)和離心時(shí)間，摸索 最佳的分離條件。 

G.如果要進(jìn)一步對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，注意全程保持無菌操作，避免微生物污染。 

H.不同動(dòng)物血液在不同比重分離液中的細(xì)胞離散系數(shù)及細(xì)胞帶電不同，用戶在制定分離液時(shí)應(yīng)提 供所需分離液的比重、動(dòng)物種屬及被分離細(xì)胞的名稱。

狗脾臟中性粒細(xì)胞分離液試劑盒

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